NLRP4E是核苷酸结合寡聚化结构域、富亮氨酸重复序列和含pyrin结构域（NLRP）家族的重要成员，能够调节病理生理过程，被认为是“雌性生育因子”之一，也是卵母细胞减数分裂中必不可少的典型母体因子。它通过调节关键的肌动蛋白帽蛋白类固醇受体共激活因子（SRC）和细胞分裂控制蛋白42同源物（CDC42）在卵母细胞减数分裂中发挥重要作用。同时，NLRP4E被认为是蛋白皮层下母体复合体（SCMC）的一个新亚基，也有文献研究表明NLRP4E对着床前胚胎发育很重要，但其在卵母细胞减数分裂中的功能及调控机制尚不明确。对NLRP4E的深入研究有望揭示其在生殖过程中更广泛的作用与潜在应用价值。安徽医科大学第一医院张东教授课题组通过构建NLRP4E基因敲除的卵母细胞模型，结合分子生物学、活细胞成像及蛋白质组学等先进技术，全面探究了 NLRP4E在卵母细胞减数分裂过程中通过SRC和CDC42调控肌动蛋白帽的形成的具体分子机制，为生殖调控网络的研究和生殖障碍治疗靶点的开发提供重要依据。此研究依赖于精确的蛋白质互作分析，百泰派克生物科技与安徽医科大学课题组紧密合作。采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合nanoLC-MS/MS纳升色谱，帮助进行了高效、精准的Co-IP蛋白互作分析服务，保障了数据的准确性与可靠性，进一步推动了该研究的深入开展。作为生物质谱优质服务商，百泰派克生物科技为客户提供Co-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析一站式服务。
一、研究方法
1、建立细胞模型
以雌性小鼠的卵母细胞为研究对象。从卵巢中分离的卵母细胞被体外培养至减数分裂阶段，模拟其自然发育过程，为后续研究提供可靠的实验模型。
2、基因敲低/敲除技术
为研究NLRP4E在卵母细胞中的功能，通过基因敲除技术构建NLRP4E缺失模型，并观察肌动蛋白帽形成的变化。通过对比敲除组与正常组的差异，深入分析NLRP4E对减数分裂的影响。
3、蛋白荧光检测
运用免疫荧光染色结合共聚焦显微镜观察，来定位和检测 NLRP4E、SRC、CDC42 以及肌动蛋白等相关蛋白在卵母细胞中的表达分布情况。
4、蛋白互作检测
通过免疫共沉淀（Co-IP）技术分析NLRP4E与SRC、CDC42等相关蛋白的相互作用，确定它们之间可能存在的直接或间接关联。为此，百泰派克生物科技提供了技术支持，帮助进行高效、精准的Co-IP蛋白互作分析服务，进一步推动了该研究的进展。
二、研究结果
1、NLRP4E是卵母细胞的优势蛋白
研究团队制备一系列单克隆抗体，并进行验证，发现NLRP4E在卵母细胞中属于优势蛋白。MALDI、WB、RT-PCR结果均表明NLRP4E丰度最大，主要表达于脑、肝、睾丸和卵巢，卵巢中NLRP4E水平在产后1 ~ 21日逐渐升高（图1 B/C/D/E/F）。NLRP4E在卵母细胞中比在GCs（颗粒细胞）中更占优势（图1 G/H），在卵母细胞减数分裂过程中聚集在细胞膜上（图1 J）。
图1. NLRP4E为卵母细胞中的优势蛋白
2、NLRP4E敲低对影响卵母细胞减数分裂及质量的影响
该研究通过siRNA转染进行NLRP4E敲低（KD）（图2 A/B/C/D），并对其进行分析卵母细胞减数分裂表型。结果发现NLRP4E KD染色体更加分散，纺锤体严重紊乱（图2 E/F/G/H/I/J）；Mito跟踪染色显示，NLRP4E KD引起线粒体聚集异常（图2右A/B/C）， NLRP4E-KD卵母细胞内ATP浓度也显著降低（图2 右D），提示卵母细胞损伤严重；体外受精显示NLRP4E KD显著降低了正常受孕率（图2右E/F）。
图2. NLRP4E敲低使卵母细胞的减数分裂异常
3、NLRP4E敲低对肌动蛋白帽形成的影响
异常的染色体易位提示NLRP4E的功能可能与肌动蛋白帽的形成或动力学有关。结果表明，NLRP4E KD在极体挤压过程中降低了肌动蛋白帽区Arp3的强度（图3C和D）。
图3. NLRP4E敲低破坏肌动蛋白帽的形成
4、NLRP4E通过S429和T430位点的磷酸化被激活
研究发现NLRP4E与NLRP4成员相比特有S429和T430（图4 A），推测NLRP4E必须经过翻译后修饰（例如通过磷酸化）才能迁移到肌动蛋白帽区。所以使用NLRP4E抗体进行IP，然后进行磷酸化蛋白富集。结果发现，从PND 1到PND 21，卵巢中磷酸化的NLRP4E （p-NLRP4E）水平逐渐升高（图4 E），与总NLRP4E （t-NLRP4E）的表达模式相似；与t-NLRP4E相比，p-NLRP4E在肌动蛋白帽区强烈聚集（图4 F），表明其在调节肌动蛋白帽形成和动力学中的作用。
为了进一步验证S429和T430磷酸化在NLRP4E功能中的重要性，研究团队将体外转录的NLRP4E- wt或S429和T430突变体mRNA注射到NLRP4E- kd卵母细胞中，并检测其成熟率（1pb率）。结果显示，与NLRP4E-KD卵母细胞相比，注射NLRP4E-WT mRNA显著恢复了1pb率，而注射NLRP4E-AA mRNA进一步降低了1pb率（图4 G/H）。因此，注射NLRP4E-WT mRNA显著增加了帽区肌动蛋白强度，而注射NLRP4E-AA mRNA则没有（图4 I/J）。
图4. NLRP4E通过S429和T430位点的磷酸化而被激活
5、免疫共沉淀方法探究p-NLRP4E如何调节肌动蛋白帽的形成
为了进一步研究p-NLRP4E如何调节肌动蛋白帽的形成，研究团队在卵母细胞裂解液中使用NLRP4E抗体进行了IP检测，随后使用MALDI-TOF-MS探究了4种可能与NLRP4E相互作用的蛋白。研究发现GRIN1和GANO1与NLRP4E相互作用（图5 B/C）， NLRP4E在细胞膜上与GNAO1共定位（图5D），而GRIN1和GANO1敲低均显著降低p-NLRP4E（图5E/F/G/H）；GANO1和NLRP4E与SRC相互作用（图5 I/J）， NLRP4E在细胞膜上与SRC共定位（图5K），而GANO1和NLRP4E敲低都显著降低了p-SRC（图5L/M/N/O）；SRC与CDC42相互作用（图5P），而NLRP4E和SRC敲低均显著增加p-CDC42（图5Q/R/S/T）。
图5. GRIN1和GNAO1激活NLRP4E并调节SRC和CDC42磷酸化和肌动蛋白帽组装
6、体外探究NLRP4E与SRC的关系
研究团队进一步分析了NLRP4E与SRC的关系，结果发现在NLRP4E敲低的MII卵母细胞中，注射SRC- mRNA可以挽救帽的形成，这表明SRC在肌动蛋白帽的形成中与NLRP4E在功能上重叠（图6 A/B）；发现体外纯化的NLRP4E可以以剂量依赖的方式磷酸化SRC（图6 C/D/E）。
图6. NLRP4E直接结合并磷酸化SRC
三、研究结论
GRIN1和GNAO1磷酸化NLRP4E的Ser429和Thr430位点，然后p-NLRP4E易位并积聚在肌动蛋白帽区，通过Tyr418位点磷酸化激活SRC。p-SRC本身可以促进帽的形成，也可以下调p-CDC42的S71位点，从而促进CDC42（gtp结合形式）的活性，促进帽的形成。
图7
研究表明，NLRP4E 在卵母细胞减数分裂过程中通过与 SRC 和 CDC42 之间的相互作用以及对它们活性的调节来实现肌动蛋白帽的形成并发挥功能。这一发现进一步完善了我们对卵母细胞减数分裂精细调控机制的认识，也为后续深入研究相关生殖疾病的发病机制（如某些因卵子质量问题导致的不孕不育）以及开发潜在的干预治疗策略提供了重要的理论依据。为了深入解析NLRP4E及其调控网络的复杂机制，精准的蛋白质组学分析不可或缺。凭借专业的技术团队和7大质量控制检测平台，百泰派克生物科技致力于为研究人员提供先进的Co-IP免疫共沉淀法蛋白互作分析服务。百泰派克生物科技(BTP)采用ISO9001认证质量控制体系管理实验室，获国家CNAS实验室认可，不仅能够满足基础研究的高要求，还可为广大科研工作者提供定制化的蛋白质组学相关服务。欢迎随时与我们技术支持沟通~
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